Tests PCR : comment se passe la recherche des variants ?

Le dépistage du coronavirus SARS-CoV-2 est l’une des clés dans la maitrise de l’épidémie. Les laboratoires ont été mis sous tension ces derniers mois face à l’afflux d’analyses PCR à mener.  « Le rythme a changé. On court toute la journée, en parcourant tout le laboratoire », confiait une biologiste dans un reportage Numerama, en juillet 2020.

Avec la progression des variants du coronavirus, les laboratoires d’analyse se sont vus confier une nouvelle tâche : identifier la présence de variants dans les échantillons. Ces « tests de criblage » se développent en France depuis fin janvier 2021. Ils nécessitent un matériel particulier et une organisation adaptée. Ces ajouts logistiques ne rendent pas leur usage possible partout, ni automatiquement.

Voici comment ça s’organise.

Le criblage des variants est une orientation

Au sein du réseau privé CerbaHealthCare, quelques plateaux techniques peuvent maintenant procéder au criblage sur place, mais l’essentiel est réalisé depuis plusieurs semaines au laboratoire Cerba. Son corps de travail est aux analyses très spécialisées, nécessitant des techniques et équipements qui ne sont pas disponibles partout — ils réalisent donc aussi des analyses pour d’autres plateaux que ceux du groupe. La différence est notamment matérielle : un laboratoire de biologie spécialisée dispose d’instruments « ouverts », adaptables à de nouveaux outils dédiés aux variants, là où, sur les plateaux techniques génériques, les appareils sont « clés en main », plus rigides.

« Sans le séquençage haut débit du génome entier, on ne pourra jamais dire avec certitude si l’on est en présence de tel ou tel variant »

La recherche des variants se déroule en deux étapes bien distinctes.

• Chaque jour, des plateaux techniques procèdent aux analyses classiques visant à déterminer si un test est positif ou non (PCR de diagnostic). Lors de cette phase, la détection de variants (PCR de criblage) ne fait pas partie du processus : des milliers de tests PCR sont accomplis tous les jours, il serait trop lourd de procéder au criblage sur des échantillons dont la positivité n’est pas encore déterminée.
• Ensuite, il s’agit de rassembler les tests positifs et de les faire parvenir par coursier au laboratoire de biologie spécialisée. C’est seulement lors de cette deuxième étape qu’ont lieu les tests PCR de criblage.

Aucune des techniques de criblage ne permet de déterminer avec certitude de quel variant il s’agit. « Les PCR de criblage ne sont que des techniques qui permettent d’orienter vers un variant. Sans le séquençage haut débit du génome entier, on ne pourra jamais dire avec certitude si l’on est en présence de tel ou tel variant », nous précise Bénédicte Roquebert, biologiste médicale au Pôle Infectiologie du laboratoire Cerba. Or, aujourd’hui, en France, le séquençage reste très rare, en dehors des enquêtes flash diligentées par la DGS (des enquêtes où 2-3 jours de tests sont séquencés pour dresser un panorama précis des variants dans le pays).

Au quotidien, les variants présents dans un échantillon sont dans leur grande majorité identifiés au travers d’un test de criblage, et non d’un séquençage. Ce sont ces résultats d’orientation qui apparaissent dans les statistiques. Cette situation demeure imparfaite selon la biologiste Bénédicte Roquebert : « On pense qu’il faudrait que soit séquencé de façon régulière, et aléatoire, un plus grand pourcentage des positifs qui circulent en France. C’est comme cela qu’on pourrait mettre en évidence des variants particuliers », explique-t-elle auprès de Numerama.

Plateau technique d'analyse des échantillons en PCR.

Source : Numerama

L’utilité de séquencer les échantillons à plus grande échelle s’observe concrètement : c’est lors d’une opération de séquençage que l’équipe du laboratoire a découvert un nouveau variant, qui n’avait pas été repéré jusque là. Le test de criblage avait orienté les biologistes vers la présence d’un variant anglais, mais en séquençant le génome, des différences sont apparues, permettant de caractériser ce variant comme étant différent. Ce n’est pas pour autant que celui-ci est forcément préoccupant, cependant le résultat s’avère forcément plus précis.

Deux techniques, une seule utilisée en raison d’une « erreur administrative »

Deux techniques différentes peuvent être mobilisées pour cribler les variants :

• La première technique relève d’une version simplement augmentée du diagnostic PCR habituel, c’est-à-dire qu’une sonde supplémentaire est ajoutée à l’appareil, pour détecter certaines caractéristiques des variants. Ces instruments permettent de « cibler et d’amplifier la région où il y aurait la délétion et une autre région où il y aurait la N501Y ». Détecter la présence ou non ainsi qu’un certain agencement de ces trois mutations (la délétion représente deux mutations ; N501Y une seule) permet d’orienter vers l’absence de variant, vers le variant anglais, ou vers le variant sud-africain.
• La deuxième technique — les réactifs TIB Molbiol — mobilise les températures de fusion des échantillons. « On va se mettre à une température particulière et on va regarder spécifiquement en combien de temps le changement de température va décrocher la sonde. Ce temps de décrochage dépend entièrement de la séquence nucléotidique du variant », détaille Bénédicte Roquebert à Numerama. En clair, en fonction de la réaction à la température, les biologistes peuvent estimer quel est le variant en présence, car chaque variant réagit dans une durée spécifique.

C'est dans ce type d'appareils, des thermocycleurs, qu'a lieu l'analyse PCR à l'aide de sondes.

Source : Numerama

Depuis début février, le laboratoire Cerba ne peut toutefois utiliser qu’une seule technique, la première et non celle des réactifs TIB Molbiol. En cause : une simple « erreur administrative ». L’ANSM aurait mal recopié la technique utilisée par le laboratoire, faisant sauter l’autorisation légale. Depuis, le dossier est toujours en attente de revalidation. Ce n’est pas sans poser un problème de taille pour les analyses : cette deuxième technique est plus avantageuse. Avec elle, « on a la possibilité de cribler les mutations E484K et K417N, afin d’être beaucoup plus précis sur le résultat : variants brésilien, sud-africain, etc. », commente Bénédicte Roquebert.

Par ailleurs, dépendre d’une seule technique signifie dépendre d’un seul type de réactifs chimiques. Face à une demande croissante envers ces réactifs, et face au flux tendu dans les besoins d’analyse, la situation est risquée puisque des ralentissements pourraient être occasionnés en cas de pénurie temporaire ou de retards de livraisons. Il est mieux de pouvoir se reposer sur deux types de réactifs différents… et donc sur deux techniques.

Contactée par Numerama, l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé ne nous a pas encore répondu.

Un flux tendu, mais des embauches pour aider les techniciens et techniciennes

Lors de notre reportage, l’été dernier, les techniciens et techniciennes étaient particulièrement sous pression, même si nous avions observé un esprit d’équipe et un dévouement venant soutenir humainement le personnel. Progressivement, le rythme a légèrement ralenti, notamment car l’offre d’analyse s’est diversifiée en allégeant le flux de demande ; car les laboratoires ont pu roder leur organisation ; et enfin avec des embauches. Mais l’arrivée des nouveaux enjeux que sont les variants génère une situation à nouveau proche d’être « tendue » au niveau humain face à la demande et au besoin de délais rapides de rendu.

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Un laboratoire de biologie spécialisée comme Cerba conduit à la fois des PCR de diagnostic et des PCR de criblage. La capacité est de 10 000 échantillons traités chaque jour, avec une activité actuelle autour de 4 000 PCR de diagnostic et 3 000 PCR de criblage. « Pour les techniciens, c’est toute une organisation : il ne faut surtout pas qu’un échantillon qui arrive pour le criblage passe en diagnostic, sinon cela fausse les statistiques et rajoute des délais, confie Bénédicte Roquebert à Numerama. Alors cela a pris un peu de temps pour que nous nous assurions que tout soit bien géré. »

Aujourd’hui, d’après la biologiste, le laboratoire a pu trouver un équilibre. « On a réembauché des CDD, des aides laboratoires, pour aider à la préparation des prélèvements. C’est un ajustement perpétuel », explique Bénédicte Roquebert.

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